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化工原料常见问题

以N-甲基吡咯烷酮(NMP)为电子供体进行反硝化的可行性及实验研究

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  摘要

  【目的】利用N-甲基吡咯烷酮(N-methylpyrrolidone,NMP)作为电子供体进行反硝化实验,以实现废水资源化。【方法】分别将NMP废水和葡萄糖作为电子供体加入到模拟的城市污水处理尾水中进行反硝化,比较2种电子供体去除硝酸盐的规律。同时考查NMP在反硝化过程中的氮素释放规律,并对所释放的氮素进行后续处理。最后再对它们作为电子供体时的反硝化污泥采用高通量测序,从微生物群落的角度分析NMP作为电子供体时其作用机理是否相同。【结果】当以NMP为电子供体时,硝酸盐氮的去除速率比葡萄糖为电子供体时要快67%。在8h的反硝化结束后,剩余的硝酸盐氮、累积的亚硝酸盐氮和NMP本身所释放氨氮之和的总氮,与葡萄糖为电子供体时相近。【结论】NMP废水可以作为电子供体用于城镇污水处理厂的深度脱氮。对2种碳源所驯化的反硝化污泥样品进行高通量分析表明,NMP与葡萄糖作为电子供体用于反硝化反应时,相关的作用机理是不同的。该项研究结果对利用含氮杂环化合物作为电子供体进行反硝化具有重要的理论指导意义。

  目前,国内外几乎所有城镇生活污水处理厂都是将处理后且满足特定水质标准的尾水排放到自然水体[1-2]。在我国,为了保护自然生态环境,许多城市污水处理厂都严格执行国家的《城镇污水处理厂污染物排放标准(18918-2002)》[3]。在该标准的各项指标中,总氮浓度相对来说较难达标。该标准中,总氮浓度小于15mgN/L方能满足一级A的排放标准。此外,许多对环境质量要求更高的地区,执行总氮浓度小于10mgN/L甚至更低的地方标准。这对许多城镇生活污水处理厂的水处理工艺提出了更高的要求。对于绝大多数城镇污水处理厂,排放尾水中的总氮主要是由硝酸盐氮组成[4]。为了降低总氮浓度,几乎所有污水处理厂都通过提供有机碳源作为电子供体将水中的硝酸盐还原,以使总氮浓度降低,来满足更高的污水排放要求。大多数污水处理厂主要是通过投加甲醇、乙酸钠或葡萄糖等使总氮中的硝酸盐得到还原。因此,碳源的投加成为各污水处理厂水处理运行成本的重要部分[5]。为降低污水处理成本,同时满足尾水的排放标准,有人采用啤酒生产废水作为碳源,这是因为啤酒废水中的主要成分都是一些可生化性较好的有机物,如糖类、醇类、酵母菌残体、酒花残糟、蛋白质和挥发性脂肪酸等,而氮、磷的浓度很低且不含有毒有害物质[6-7]。

  然而,在现实生产中还有一种工业废水也具有良好的可生化性,其主要成分是N-甲基吡咯烷酮(N-methylpyrrolidone,NMP)。NMP是一种含氮杂环化合物,广泛地应用于锂电池等新能源的生产过程中,其分子式为C5H9NO。该废水是在NMP精馏过程中产生的,其中约80%的有机物是NMP。以往人们都是将其作为一般的工业废水进行生物处理[8]。这既需要消耗大量的动力,又浪费了蕴藏其中的有机碳源。鉴于该废水具有良好的可生化性,虽然含有氮元素,但仍有人尝试利用其作为反硝化的碳源[9-10],并取得了较好的效果。将NMP作为电子供体时,其通过微生物的作用,通过反应式:C5H9NO+9H2O→5CO2+NH3+24H释放出电子供体(H表示电子供体,H=H++e–)。作为对比,若采用葡萄糖作为电子供体时,其生物水解过程则要简单许多,其总的反应式为:C6H12O6+6H2O→6CO2+24H。由于NMP的分子结构与葡萄糖的结构明显不同,且更为复杂。当将NMP作为反硝化碳源时,其电子的释放以及还原硝酸盐的机理与葡萄糖有什么不同,以往几乎没有专门的研究。为此,本研究将NMP作为碳源用于反硝化反应的电子供体,考察硝酸盐的去除规律,并与葡萄糖进行比较。通过比较这2种有机碳源进行反硝化反应过程中微生物群落不同,探究其不同的作用机理。为NMP废水作为碳源应用于实际污水的处理,尤其是通过提高污水中总氮的去除效率,实现污水的超净排放提供理论基础。

  1材料与方法

  1.1化学试剂以及母液的配制

  本研究所用化学试剂全部购自上海泰坦科技股份有限公司。所有溶液配制时均使用电阻率为18.2MΩ·cm的去离子水。

  N-甲基吡咯烷酮(NMP)母液的配制:用移液管取4.73mLNMP至50mL的容量瓶,再用去离子水定容后得到浓度为1mol/L的NMP母液,并置于4°C冰箱内保存。

  NO3–-N母液的配制:用去离子水将30.35g的硝酸钠溶解后,倒入250mL的容量瓶定容,得到浓度为20gN/L硝酸盐氮的母液,最后置于4°C冰箱内保存。

  磷酸盐缓冲溶液的配制:分别称取21.75g磷酸氢二钾和4.26g磷酸二氢钾,并用去离子水将其溶解后,倒入1L的容量瓶中定容混合均匀后置于冰箱内保存备用。

  磷酸盐缓冲液母液的配制:称取4.39g磷酸二氢钾,溶解于1L去离子水中,得到初始浓度为1gP/L的溶液,同样置于4°C冰箱内保存。

  1.2反硝化活性污泥的驯化

  实验所用的原始活性污泥取自于上海某污水处理厂的二沉池。驯化前,先用自来水清洗该污泥3次,以去除污泥中的一些杂质[11]。随后,将清洗后的污泥沉淀30min,分别取沉淀后的污泥400mL,置于2个1L的锥形瓶中,分别用作以葡萄糖和NMP作为电子供体进行反硝化污泥的驯化。驯化初始阶段,2个锥形瓶都用葡萄糖作为碳源进行。具体做法是,在2个1L的锥形瓶中分别加入550g葡萄糖、5mLNO3–-N母液和1mL磷酸盐母液,随后定容到1L,充氮气10min后,将锥形瓶封口并置于磁力搅拌器上开始反硝化污泥的驯化。对于以葡萄糖为碳源的反硝化污泥驯化时,每24h更换一次新鲜培养液。更换时,先停止搅拌让污泥沉降30min以上,随后将700mL的上清液倾出,再补充等量的新鲜培养液(添加的量和操作方法同上)。而以NMP为碳源的反硝化污泥驯化步骤,与葡萄糖为碳源时基本一样,但葡萄糖的添加量逐步下降,而NMP的添加量逐步上升,直至用NMP全部取代葡萄糖作为碳源。在此过程中,总的化学需氧量(chemicaloxygendemand,COD)浓度和NO3–-N的浓度始终保持为500mgCOD/L和100mgN/L左右。同样是每24h更换一次新鲜培养液。此过程持续约5周。

  1.3间歇脱氮实验

  将驯化好的2种污泥沉降30min后,分别取200mL的污泥置于2个1L的锥形瓶内,随后,向2个锥形瓶中均加入5mL的NO3–-N母液和6mL磷酸盐缓冲溶液,紧接着分别在2个锥形瓶中加入2.6mLNMP母液和455g葡萄糖作为反硝化碳源,最后加入自来水定容至1L。此时对应的混合液悬浮固体(mixedliquorsuspendedsolids,MLSS)为(2280±50)mg/L,相应的COD浓度均约为500mg/L,而NO3–-N的初始浓度均为100mg/L。这样,对于以葡萄糖为碳源时的C/N比为5.0。若不考虑NMP自身所含的N,则C/N比同样为5.0,但考虑到NMP自身所含有的N,则此时C/N比约为3.7。进行反硝化之前,用高纯氮气充气10min后,密封瓶口置于磁力搅拌器上在转速350r/min和温度30°C条件下进行反硝化反应。定期取样测定溶液的NH4+-N、NO2–-N和NO3–-N。

  由于NMP是一种含氮杂环化合物,当其作为电子供体进行反硝化时会释放出氨氮,为避免总氮浓度过高,对于反硝化后的出水,再用好氧污泥进行好氧处理。好氧处理在1L的量筒内进行,污泥量约为3g/L。

  1.4反硝化污泥的高通量测序

  在上述实验结束后,葡萄糖和NMP作为碳源进行反硝化的污泥沉降30min后,取约5mL装入5mL的离心管内加冰块冷却送上海派森生物技术有限公司进行高通量测序,分别定义这2个样品为GLU和NMP。根据该公司的说明,首先用DNA提取试剂盒(FastDNABiomedicalsSPINKit)进行总DNA的提取。用NanoDrop2000检测DNA浓度和纯度,通过1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取物的质量。用515F(5′-GTGCCAGCCGGTAA-3′)和907R(5′-CCGTCAATTCTTTRAGTT-3′)作为上下游引物针对2个污泥样品16SrRNA基因的V3–V4高变区进行PCR扩增。PCR产物用2%琼脂糖凝胶回收,并用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒(Axygen)纯化。QuantiFluorTMST(Promega)用于定量分析。根据IlluminaMiSeq平台的标准操作程序,将扩增片段构建到测序文库中,然后使用Illumino的MiSeqpe300进行高通量测序。微生物群落分析以Silva数据库作为参考进行[12]。

  1.5分析方法

  硝酸盐、亚硝酸盐和铵离子的测试使用型号为IC-5000的离子色谱,阴离子色谱柱的型号为DionexIonPacAS19IC,抑制剂类型设定为ASRS_4mm,电流设定为124mA,流速为1mL/min。阳离子色谱柱的型号为DionexlonPacCS12A,抑制剂类型同样为ASRS_4mm,电流设定59mA,流速为1mL/min。

  NMP使用高效液相色谱(HPLC)进行测定,反向色谱柱的型号为AgilentHC-C18(2)(5μm,4.6mm×150mm),流动相设定参数为甲醇:去离子水=60:40(体积比),检测波长为230nm,柱温为40°C,流速为1mL/min,保留时间约为2.16min。

  2结果与讨论

  2.1基于未驯化污泥NMP与葡萄糖进行反硝化的比较

  如图1所示,当采用未驯化的污泥进行反硝化,以葡萄糖为电子供体时,硝酸盐的降解速率相对较慢。经过8h的反硝化反应,硝酸盐的去除率为62%左右,而以NMP为电子供体时,硝酸盐几乎未去除。这就说明,从污水处理直接获取的活性污泥,换了实验条件后,并不能马上适应新的环境。因此,相应的驯化过程在污水处理中是非常必要的。

  2.2NMP和葡萄糖为电子供体进行反硝化的比较

  图2表示的是分别利用葡萄糖(glucose)和NMP作为碳源进行反硝化反应时,硝酸盐的去除速率(图2A)和亚硝酸盐生成的规律(图2B)。其中,硝酸盐的去除可以用一级反应速率动力学很好地描述,该动力学反应式经过积分后可以得到。其中C0和C(mg/L)为初始和t(h)时刻的硝酸盐浓度,k为一级速率常数(h–1)。如图2A所示,相比葡萄糖,当以NMP作为电子供体进行反硝化时,硝酸盐的去除速率比葡萄糖要高67%。在此过程中,经过分析测试NMP已完全消失,转化为后续的中间产物直至矿化。

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  图1分别以葡萄糖和NMP为电子供体对未驯化活性污泥进行反硝化的效果

  图2B反映了亚硝酸盐的变化规律。从图中可以看出,当采用NMP为碳源时,亚硝酸盐的生成积累量比葡萄糖的多。但它们都是在2–4h时亚硝酸盐的浓度达到峰值,随后则逐渐下降。实验结果表明,在反硝化反应进行到16h后,硝酸盐和亚硝酸盐都基本去除完毕(本文未显示)。此外,在NMP的降解过程中,至8h时释放了大约20mgN/L的NH4+-N,随后不再增加。综合比较葡萄糖和NMP作为电子供体进行反硝化的效果,葡萄糖为电子供体时,至8h时,剩余硝酸盐氮和积累亚硝酸盐氮共72mgN/L,而NMP为电子供体时,剩余的硝酸盐氮、积累的亚硝酸盐和释放的氨氮共有76mgN/L。这个结果表明,与葡萄糖相比,NMP是一种潜在的电子供体可以用于反硝化。该实验结果与陈松筠等[9]的实验结果是一致的。比较2种不同的电子供体在进行反硝化过程中的情况,硝酸盐的去除和亚硝酸盐的生成具有不同的规律,由此可以得到一个假设,即它们进行反硝化的机理应该是不同的。这或许与2种底物的分子结构不同密切相关,它们的降解代谢途径和中间产物相差很大,这应该可以从2种反硝化污泥的微生物群落分布得到解释。

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  图2分别以葡萄糖和NMP为电子供体进行反硝化的效果

  2.3反硝化过程中NMP中间产物的归趋

  在利用NMP作为电子供体还原硝酸盐过程中,NMP分解为甲胺,这与Cai等[13]的研究结果是一致的。由于NMP最初就是通过g-丁内酯与甲胺合成而得,在生物降解时,通过一系列生物反应开环之后,生成一甲胺和丁二醛。此时,原始NMP中所含有的N,在开环之后,都存在于一甲胺中。随着一甲胺(CH3NH2)的进一步降解,其中的N则以NH4+-N的形式释放出来。但是在缺氧条件下,只有少量的N是以氨氮(NH4+-N)的形式释放出来,如图3A所示。对比图2A和图3A的实验结果,由NMP所释放出来的N只占5%左右。当所含的这些氮(以甲胺或氨的形式存在)经过好氧处理后,甲胺迅速被降解并释放出氨氮。如图3B所示,释放的氨氮在好氧条件下,在3h内全部去除,并生成少量的硝酸盐。相比最初的硝酸盐氮(NO3–-N)的浓度,所剩余的硝酸盐氮只有初始硝酸盐氮浓度的0.5%。这个浓度远低于污水的排放标准所要求的浓度。由此可以判断,NMP用作反硝化的电子供体不会造成出水中总氮浓度的升高。该研究结果表明,NMP生产过程中所产生的废水,是可以作为电子供体进行反硝化的。此外,根据NMP的分子式(C5H9NO)可知,该化合物的有效电子数为24eq/mol(24H,其中H=H++e–)。所含有的一个N在生物降解过程中,首先是以NH4+-N的形式释放出来,在好氧条件下,会转变为NO3–-N,即还原1个N,需要的有效电子数为5H,按照反应式:NO3–+5H→0.5N2+2H2O+OH–进行还原反应需要5H,而NMP的生物降解过程中,单加氧反应和还原反应等[13],需要8H,这样就有11H可供外源硝酸盐的还原。因此,从理论上来讲,NMP是可以作为电子供体进行反硝化的。该实验为废水的综合利用奠定了良好的理论和实践基础。

  2.4微生物多样性分析

  α多样性分析可以反映出这2种反硝化污泥中微生物物种的丰富度(Chao1指数)和物种多样性(Shannon和Simpson指数)。Chao1指数表示微生物群落的丰富度,Chao1值越大,丰富度越高;Shannon和Simpson指数越大,生物多样性越高或群落中的物种数越多,物种多样性程度高。如表1所示,比较2个样品可以发现,以NMP作为碳源驯化的反硝化污泥中,Chao1、Shannon和Simpson指数均高于以葡萄糖为电子供体的反硝化污泥。这是因为NMP的分子结构是一个五元含氮杂环结构,其分子结构比葡萄糖的分子结构要复杂很多。对于NMP,其降解过程先后通过水解生成N-甲基丁二酰胺,同时释放出一甲胺,开环之后逐步生成各种有机酸[10,14]。因此,相关微生物群落的丰富度和多样性显然是应该高于以葡萄糖为碳源所驯化的反硝化污泥中的微生物群落,实验结果也印证了这一推断。

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  图3在缺氧和好氧情况下NMP中的N的释放与转化

  为了进一步探讨NMP作为电子供体进行反硝化的可行性,将其与葡萄糖(GLU)进行比较,探讨它们的机理是否相同。

  NMP生物降解过程中先是通过单氧化反应转化为1-甲基-5-羟基-2-吡咯烷酮(C5H9NO2),然后脱氢形成1-甲基-2,5-吡咯烷二酮(C5H7NO2),再通过一个单氧化转化为2-羟基-N-甲基琥珀酰亚胺(C5H7NO3)。随后水解生成丁二醛(C4H6O2)和甲胺(CH3NH2)。丁二醛通过2次羟基化转化为丁二酸(C4H6O4),并进入三羧酸循环,通过呼吸完成矿化和产生能量。经过这一系列的反应,释放出20eq/mol电子,除去生物降解和内源硝酸盐还原需要消耗11eq/mol外,可以提供11eq/mol用于外源硝酸盐的还原[13,15]。而葡萄糖在厌氧条件下首先经过一系列的代谢生成丙酮酸,最后进入三羧酸循环,在此过程中释放出电子为硝酸盐的还原提供电子供体。

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  表1两种微生物样品α多样性指数

  由于NMP与葡萄糖在进入三羧酸循环前的途径有着明显的差别,为此分别对这2种电子供体驯化的反硝化污泥取样进行高通量测序,从它们微生物多样性的角度比较其差异。

  2.5GLU和NMP内微生物群落结构和相对丰度分析

  图4所示是2个样品(GLU和NMP)在属水平上位于前20细菌的丰度。从图中可以看出,丰度差异最明显的是Ottowia、Gemmobacter、Thauera和Brooklawnia等菌属。在样品GLU中,Ottowia的丰度高达45.2%,但在样品NMP中,其丰度只有0.8%;而Gemmobacter菌属在NMP样品中,其丰度高达32.4%,但在GLU中则几乎为0;Thauera菌属在2个样品中的丰度差值高达13.6%;Brooklawnia菌属在GLU样品中的丰度为6.9%,但在NMP样品中几乎为0。据报道,Ottowia通常是生物处理水产养殖废水[16]、石化废水[17]和垃圾渗滤液[18]中的重要细菌属。由于这2个菌属都具有反硝化功能[19],且这些废水处理的主要目的便是通过反硝化去除水中的氮素。再加上葡萄糖是一种可生化性较好的有机物,即葡萄糖可以直接水解并释放出电子(H),Ottowia菌比较容易地利用葡萄糖水解后所释放的电子使硝酸盐得到还原。而当利用NMP作为电子供体进行反硝化时,在微生物的作用下,首先是通过单加氧反应后,再开环转化为丁二酸和甲基氨基丁酸[10,20-21],最后才释放出电子。而Gemmobacter菌属是可以利用吡啶作为生长的唯一碳源和氮源[22]。由于吡啶和NMP都属于含氮杂环化合物,据此可以判定菌属Gemmobacter也具有利用NMP为唯一碳源和氮源进行生长的功能。同时考虑到菌属Gemmobacter具有反硝化功能[19],比较图1的实验结果表明,只有较高的Gemmobacter菌属丰度才能保证很好地利用NMP作为电子供体进行反硝化。图4中Gemmobacter丰度的分布结果很好地解释了这点。

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  图4不同电子供体的反硝化污泥在属水平上的细菌相对丰度

  对于Thauera菌属,在样品GLU和NMP中,它的丰度分别是9.3%和22.9%。同样,Thauera菌属也是一种典型的反硝化功能的菌,它可以利用包括芳香化合物在内的多种碳源进行脱氮[23]。这就很清楚解释了为什么样品NMP中Thauera菌属的丰度明显高于样品GLU的原因。

  菌属Brooklawnia在GLU样品中的丰度高达6.9%,但在NMP样品中的丰度不足0.04%。据报道,菌属Brooklawnia是制糖厂废水处理中的优势微生物[24],而制糖废水的代谢过程与葡萄糖的代谢有相似之处。这也说明了为什么Brooklawnia在GLU样品中的丰度远远高于NMP样品中的丰度。WS6菌属于Patescibacteria门,它在样品GLU和NMP中的丰度分别是6.4%和4.3%。Patescibacteria具有同步硝化和反硝化的功能[25]。

  3结论

  分别以葡萄糖和NMP作为电子供体使硝酸盐还原。对比2种碳源对硝酸盐还原的速率发现,NMP作为电子供体时,硝酸盐的去除速率要比葡萄糖快。考虑到NMP作为电子供体时,由于其自身含有的氮元素,在反硝化过程中剩余总氮的浓度与葡萄糖为电子供体时相近。因此,虽然NMP是一种含氮杂环化合物,通过与葡萄糖的对比,NMP是一种潜在的可以用于反硝化的电子供体。通过对NMP和葡萄糖驯化的反硝化污泥的高通量测序分析,发现它们的微生物群落分布明显不同,这与NMP和葡萄糖的代谢途径有着明显差别相对应。


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