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化工原料常见问题

DMSO外周血干细胞的冻存

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所采集的造血干细胞(骨髓或PBSC)需根据不同移植需求,在不同时间回输。如异基因移植时,在回输前再进行采集即可,直接回输新鲜采集的产物,无须保存;而自体移植患者,从采集到回输可能经历数日至数月,需选择恰当的体外保存方式,才能保持其活性。  

表造血干细胞保存方法及原则  

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(一)非冷冻保存  

非冷冻保存,是一种比较便捷、经济的保存方式,不需要特殊设备,适合短期储存干细胞,一般可采用室温或4℃冰箱保存。采用这种方式,干细胞活性可保存数小时至数天。如采集非血缘供者骨髓或外周血造血干细胞移植,需要经过长距离运输,往往24~48小时后才能给患者输注,多采用这种保存方式。部分患者自体干细胞采集后,随即进行预处理,如果预处理方案短且药物半衰期短,也可选择这种方法保存干细胞。文献报道4℃保存造血干细胞24小时和72小时后,cFU-GM的回收率分别为81%和57%,BFU-E为45%和28%,随时间延长下降。Pettengell等也报道,在4℃时保存24、48和72小时后,外周血和骨髓干细胞的CFU-GM回收率相当,分别平均为90%、72%和68%,提示4℃短期保存干细胞可有效用于移植。但是也有其他作者报道保存96小时后,骨髓CFU-GM仅下降3%,但是PBSC则降低高达95%,具有明显差异。一般公认4℃条件下保存,在48小时内HSC活力无明显下降,但不能采用这种方法长期保存。  

(二)外周血干细胞的低温保存技术  

为了采集到满足临床所需数量的PBSC,患者往往需要经过3~5次的分离,甚至再次动员采集,这样每次采集到的细胞必须先经低温保存备用。在低温保存过程中,为了防止细胞内冰晶形成、渗透压改变、细胞结构紊乱等导致细胞损伤,冷冻保护剂的使用是必要的。二甲基亚砜(DMSO)具有渗透性,进入细胞后使细胞内水分溢出,减少细胞内冰晶形成从而减少细胞损伤。DMSO是最常用的细胞冷冻保护剂。通常在每次分离后将血细胞悬液浓缩至50ml左右,在4℃冰箱内预冷后,缓慢加入含DMSO的RPMI1640营养液,使DMSO的终浓度为10%,然后分装于血液冻存袋内(100ml/袋),经程控冷冻系统降温至-80℃,再投入液氮中(-196℃)贮存。程控降温、液氮保存已被证明是保存HSC的有效方法。Humpe报道PBSC经-196℃液氮保存后,CD34+细胞无明显减少。Farle等也报道,PBSC经一次冷冻-解冻过程,CD34+细胞活力和cFU-GM的回收率分别为71%和51.5%,经第二次冷冻-解冻过程,细胞活力和CFU-GM回收率保持与第一次近似。单用DMSO有较好的保存效果,但DMSO常温下对细胞有毒性作用,大量输入体内可引起的严重不良反应,如恶心、呕吐、过敏反应、剧烈头痛、血压急剧升高、心率缓慢、呼吸困难等,应尽可能减少其用量。羟乙基淀粉(HES)、右旋糖酐(Dextran)等也能够减少结晶物产生,作为冻存保护剂。  

Hernandez等报道用6%HES和5%DMSO作为PBSC的冷冻防护剂,不经程控降温直接在-80℃冰箱中保存。结果显示CFU-GM和BFU-E回收率分别为86.6%±12.3%和71.8%±14.7%,台盼蓝拒染率>80%,用该法冻存的PBSC进行移植,全部显示早期植活。Takaue等比较了两组进行PBSCT的患者,分别采用上述冻存方法或程控降温方法保存,移植后两组患者粒细胞和血小板的恢复时间无差异,提示合用两类保护剂是有效可行的。Katayama等也报道-80℃也可长期保存PBSC,5年后测定cFU-GM和bFU-E回收率都在70%以上。目前该方法广泛应用于PBSC的保存。


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