山  核  桃  

作用与功效  

山核桃（CaryacathayensisSarg.），胡桃科山核桃属落叶乔木，属胡桃科山核桃属，集中分布在中国江浙、湖南、湖北一带，是极具特色和经济价值的林产品。山核桃种仁含蛋白质7.8%～9.6%，含油率69.8%～74.01%，其中不饱和脂肪酸占88.38%～95.78%，并含有丰富的人体所必须的矿质元素。山核桃油味清香、营养丰富，是优良的食用油，具有润肺、滋补和康复之功效，还可降低血脂，预防心脑血管疾病。山核桃种仁中主要营养成分有17种氨基酸，8种脂肪酸，在营养价值和保健作用方面具有更独特的优点，是极具开发和研究价值的植物源天然产物。  

酚类的危害  

1、多酚类物质不仅能产生涩味，而且可引起饮料、啤酒、茶等产生沉淀，影响食品口感及美观。  

2、多酚类物质还具有潜在的细胞毒性，大量研究证实较高浓度的多酚对体外肿瘤细胞株和正常细胞都具有显著的细胞毒性。  

问  

如何去除较高浓度多酚类物质？  

周瑜[1]等发现，近几年，山核桃及其他植物源功能食品和保健产品增长十分迅速。然而对许多植物源天然产物而言，如山核桃、余甘果、三叶青、茶、铁皮石斛等，为了更好地提升其在食品饮料工业或生物技术领域的应用，要解决的一个难题是如何去除较高浓度的多酚类物质，其中山核桃多酚含量高达300~600mg/100g干质量核桃仁。  

目前的研究只是着眼于植物源天然产物本身并对其多酚去除率等指标进行研究。在食品安全问题越发引人关注的今天，很少有人用生物学方法对去除多酚后植物源天然产物的细胞毒性进行毒理学评价。  

本研究拟以新鲜山核桃为原材料，通过PVPP吸附法去除其中的多酚，用人源神经肿瘤细胞系和人源正常细胞的体外细胞毒性为指标，对植物源天然产物的多酚去除效果进行评价。  

1PVPP不同量处理对去除山核桃水提物中多酚的影响  

不同量PVPP处理山核桃水提物后，用福林酚试剂法测定水提物中多酚残留来评估其去除效果。由图1可知，10mgPVPP处理1mL山核桃水提物（0.5g山核桃仁）明显地降低了水提物的多酚含量。  

随着PVPP量的增加，山核桃水提物中多酚去除率逐渐趋向饱和，PVPP的量达到40mg时多酚去除率不再明显增加。对不同量PVPP处理后山核桃水提物的多酚去除率进行测算，结果显示PVPP的量为10mg时多酚去除率达到67%，随着PVPP量的增加，多酚的去除率快速上升。PVPP的量为40mg时去除率达到85%，此后去除率上升趋势变慢，PVPP的量为80mg时多酚去除率达到88.9%。

2PVPP不同处理时间对山核桃水提物中多酚吸附的影响  

根据PVPP不同量去除山核桃水提物多酚含量的实验结果，选取40mg为后续实验的处理用量，对处理不同时间后山核桃水提物与福林酚反应液的吸光度计算多酚去除率。结果如图2所示，在1~10min的处理时间段内，山核桃水提物中多酚的去除率明显增加，至10min时去除率达到84.6%。此后多酚去除率随处理时间的增加并无太大变化。  

3PVPP处理前后山核桃水提液对SH-SY5YEGFP及HUVEC细胞存活的影响  

PVPP处理前后的山核桃水提物用PBS稀释后，按浓度梯度处理细胞，使山核桃水提液最终体积浓度分别为1%、5%、10%，对应的山核桃质量浓度（按生药量计算）分别为5、25和50mg/mL。  

从图3可以看出，用PVPP未处理过的山核桃水提物处理SH-SY5YEGFP细胞，其细胞的荧光强度明显低于PVPP处理过的山核桃水提物实验组。  

由图5A可以看出，通过MTT法检测细胞增殖抑制率发现，山核桃水提物PVPP未处理组的细胞存活率显著低于处理组（p＜0.01），且有剂量效应。  

由图4和图5B可以看出，在HUVEC正常细胞中，山核桃水提物PVPP未处理组不仅细胞数量明显低于处理组，而且细胞形态明显畸形，MTT检测发现PVPP未处理组细胞存活率明显低于处理组（p＜0.01），说明癌细胞株和正常细胞对山核桃多酚呈现同样的毒性反应。同时也说明PVPP处理前的山核桃水提液的细胞毒性要远远大于处理后的，因此用PVPP可以有效地将多酚去除到一个对细胞安全的水平。  

结论与讨论  

本实验利用福林酚试剂法测得山核桃鲜果仁多酚含量。利用PVPP吸附技术对山核桃鲜果仁多酚含量进行去除，并研究PVPP用量及处理时间对山核桃多酚去除率的影响。分析得出新鲜山核桃仁中总多酚浓度为1.1mg/g，去除其多酚时，最佳量效比为8%（40mgPVPP/500mg鲜山核桃），时间为10min，一次去除率可达84.6%。质量比为16%（80mgPVPP/500mg鲜山核桃），时间为1h时，去除率达到88.9%。  

对比之前关于多酚吸附的其他方法，发现PVPP有一系列优势，如表1所示。再对比之前PVPP对其他植物多酚去除效率的报道，比如对绿茶饮料中茶多酚以及余甘果汁中多酚的去除，其最佳去除率分别约为50%和89.2%，而本实验最佳去除率达到88.9%，用PVPP去除山核桃中多酚的效果已经达到之前文献报道的最佳水平。  

进一步，用生物毒理学评估方法验证PVPP去除多酚达到了一个生物安全的水平。通过建立体外细胞模型，检测PVPP处理前后的山核桃水提液对细胞的毒性。未处理的山核桃水提物体积浓度为1%~10%时，无论是SH-SY5Y-EGFP肿瘤细胞还是HUVEC正常细胞均出现明显的细胞死亡，细胞死亡率从40%左右上升到70%左右，具有明显的剂量效应，说明山核桃含有的多酚对肿瘤细胞和正常细胞均具极为明显的细胞毒性。相反，PVPP处理后的山核桃鲜果仁水提物对肿瘤细胞和正常细胞均未呈现细胞毒性，说明肿瘤细胞株可以用来替代正常细胞进行细胞毒性评估，因为肿瘤细胞比正常细胞繁殖更快，所以可以节省毒理学评估时间，节约成本。PVPP处理方法可以将以山核桃为代表的植物源天然产物水溶性成分中多酚去除到一个对人体细胞安全的水平，有效消除可能会对人体产生的潜在危害。  

由以上分析可知，按照文中的评估方法，用PVPP去除多酚并创新性地结合体外细胞模型，不仅得到更好的时间以及量效关系，而且体外细胞模型可以用来评估多酚去除到什么程度就达到安全水平，为工业界在多酚去除工艺上做到既降低成本又保障安全提供一种既科学，又简单、省钱的评价方法。为此类物质在食品和饮料等工业或者生物技术领域的进一步利用和研究提供了更多的选择，也为多酚研究开创了新思路。