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化工原料常见问题

DMSO细胞冻存的实验步骤&注意事项

频道:化工原料常见问题 日期: 浏览:171

  细胞冻存实验用于保护细胞免受损伤,以便在需要的时候重新复苏和使用,对于保存珍稀细胞资源、制备细胞库、研究细胞生物学等方面都具有重要意义。

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  实验步骤


  1.细胞冻存液提前配置:冻存液配置比例根据实验习惯即可,若细胞不多或使用人数较少,建议一次少量配置,配置完成后,由于DMSO的存在,因此需要严格避光保存。


  2.需要冻存的细胞密度要求≥90%,镜下观察细胞,当细胞密度满足要求后,弃掉原有培养基,沿培养皿边缘加入1ml温浴的PBS缓冲液清洗。


  3.弃掉PBS缓冲液,加入胰酶消化细胞,消化时间根据细胞类型决定。


  4.消化到时间后,加入二倍胰酶体积的培养基终止消化,用移液器将细胞全部吹下,转移至离心管内。


  5.离心机常温800rpm,离心5min。


  6.弃上清,加入1ml配置好的冻存液,用移液器轻轻吹打10-15次混匀。


  7.冻存管标记好相应信息,包括细胞名称、代数、冻存时间、操作者姓名等,将上述混悬液全部转移至冻存管内,拧紧冻存管管口,放入程序降温盒内。


  8.将程序降温盒放入-80℃冰箱内,36h后可从程序降温盒内拿出细胞放在细胞冻存架上保存。

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  常见问题


  1.细胞冻存管具体存放方式、温度、时间等由实验室条件决定,我所述只是我实验过程中冻存细胞的保存方法。


  2.关于冻存液的配置,我实验所用配方为培养基:血清:DMSO=7:2:1,整个实验过程中冻存的细胞复苏状态良好。


  注意事项


  1.在冻存管上标记信息时使用一支质量较好的马克笔,保证在后期进行细胞复苏时信息不会被水或酒精洗掉。


  2.细胞冻存时应保证细胞状良好,无污染。


  3.细胞冻存原则为“慢冻”,因此,细胞加入冻存管后如何保存应严格遵守冻存流程,避免冻存太快,产生结晶。


  4.二甲基亚砜(DMSO)是一种细胞保护剂,在深低温情况下可防止细胞内形成冰晶,减少细胞损伤,因此冻存液配置中DMSO必不可少,但可以改变血清的比例,对于一些原代细胞或较为重要的细胞,可将血清比例提高至50%-90%,保证其有较高的存活率。


  5.细胞冻存后再进行复苏时,细胞数量不可避免会减少,因此,在冻存前,细胞量要足够多,密度≥90%。


  6.细胞混悬液加入冻存管后,不宜在常温放置过久,因此应先将细胞冻存盒放入冰箱,再进行后续相关实验。


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