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化工原料常见问题

冷冻干燥的保护剂和添加剂

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  生化、发光等冻干粉形式的校准质控在冷冻干燥和储存过程中,蛋白质等活性组分存在变性、稳定性下降的风险。本文对冷冻干燥过程的变性机理以及常用的冷冻干燥保护添加剂进行了概述。

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  冷冻干燥和储存过程的变性机理


  冷冻干燥过程中,低温效应、冻结效应和脱水效应会导致蛋白质等活性组分的变性。


  低温效应在于生物制品通常需要冷藏或冷冻保存,在使用时需要进行复温,而生物制品的活性组分在一定温度范围内的重复降温与复温过程中会发生变性。如卵清蛋白在-10℃~-40℃之间,其活性显著降低,在-192℃时,其活性几乎没有变化。


  冻结效应在于冷冻过程中,离子浓度的增加、冰晶的形成与生长、pH的变化和相分离会导致活性组分不同程度的变性。如在冷冻过程中,不断结晶会导致溶液浓度快速升高、离子浓度增加,促进了变性化学反应的发生。同时,生物制品溶液在冷冻过程中也会产生大量的冰-水界面,蛋白质等活性组分分子会被吸附到界面上,从而破坏蛋白质的天然褶皱结构,最终导致蛋白质变性。除此之外,冷冻过程中溶液的pH也会发生变化,如含有蛋白质的pH值为7.0的磷酸盐缓冲液在冷冻时,由于NaH2PO4的溶解度远大于Na2HPO4,当溶液的温度达到三相共晶点时,pH值显著降低,蛋白质发生物理聚集和化学变性。


  脱水效应是因为水溶液中的蛋白质经过充分水合作用后,在蛋白质表面附着一层水合层,在干燥过程中,有一部分的结合水被除去。富含结合水的蛋白质在脱水过程中暴露在疏水环境中,将质子转化为带电羧酸基团,破坏了蛋白质中的电荷平衡,电荷密度的降低可能促进蛋白质分子间的疏水作用,蛋白质的天然结构被破坏而发生变性聚集。


  在储存过程中,生物制品的活性组分也会发生变性。主要是蛋白质在储存过程中,分子间可能会发生物理(非共价)和化学(共价)相互作用而导致蛋白质凝集,蛋白质分子中含有的天冬酰胺和谷氨酰胺两种氨基酸易发生脱酰胺作用,赖氨酸和精氨酸可以与还原性糖(葡萄糖)形成碳水化合物,蛋氨酸、胱氨酸、组氨酸、色氨酸和酪氨酸的残基侧链可能发生氧化反应,并且冻干品中极少量的水分在贮藏过程中仍会发生水解作用。这些物理个化学反应会随着储存过程中时间的延长而加剧,使得蛋白质等活性组分变性。


  总之,生物制品的冷冻干燥过程是一个多步骤过程,会产生低温、冻结和脱水等多重效应。即使冷冻干燥完成后,在长期保存过程中也很难保证生物制品活性组分的稳定性。为了防止生物制品在冷冻干燥和储存过程中活性组分变性,通常需要添加保护剂。


  冷冻干燥保护添加剂的分类


  按分子量可以分为低分子化合物和高分子化合物。


  低分子化合物可以分为酸性、中性和碱性物质。酸性物质主要包括谷氨酸、天冬氨酸、苹果氨酸和乳酸等;中性物质主要为葡萄糖、肌醇、乳糖、蔗糖、棉籽糖、海藻糖、山梨醇D、L-苏氨酸和木糖醇等;碱性物质主要为精氨酸和组氨酸等。一般认为,低分子化合物在冻干过程中直接发挥作用,而高分子化合物则是促进低分子化合物的保护作用。因此,制备保护剂配方时,多将低分子化合物和高分子化合物配合使用。


  按保护剂功能和性质可以分为冻干保护剂、填充剂、抗氧化剂、酸碱调节剂和冻干加速剂。


  冻干保护剂主要是在冷冻干燥过程中防止活性组分变性,如甘油、DMSO、海藻糖、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等;填充剂可以防止有效组分随水蒸气一起升华逸散,并且可以使有效组分成形,如甘露醇、乳糖和明胶等;抗氧化剂可以防止生物制品在冷冻干燥及储存过程中发生氧化变质,如维生素D、微生物E、蛋白质水解物、硫代硫酸钠等(相关作用机理和分类可查阅前期发表文章“抗氧化剂:提高试剂的抗氧化性能”);酸碱调节剂可以在冷冻干燥过程中将pH值调整到活性组分最稳定的范围内,如磷酸、山梨醇、EDTA和氨基酸等。冻干加速剂可以减少冷冻干燥时间、降低生产成本,通常在冻干配方中加入叔丁醇来加速冷冻干燥过程,叔丁醇在冻结时会形成针状结晶,冰晶升华后留下了管状通道,使水蒸汽流动阻力大大减小,显著提高升华速率。


  按物质的种类可以分为糖/多元醇类、聚合物类、表面活性剂类、氨基酸类和盐类。


  糖类一般可分为单糖(葡萄糖、果糖、半乳糖等)、低聚糖(蔗糖、麦芽糖、乳糖、海藻糖等)和多糖(淀粉、纤维素、果胶等)三类。从理论上讲,在冷冻干燥过程中,如果糖类与生物制品活性组分的分子形成氢键而代替了原有水的位置,就能对这些活性组分提供保护作用。单糖在冷冻过程中只能提供非常微弱的稳定作用,使得蛋白质在脱水干燥前就发生了不可逆变性。因此,在冷冻干燥配方中,一般不单独使用单糖作为保护剂,通常与其他赋形剂联用。冷冻干燥过程中,经常使用低聚糖,特别是二糖作为保护剂,因为二糖在冷冻过程中可以起到低温保护剂的功能,又能在干燥过程中起到脱水保护剂的作用。二糖又分为还原性(乳糖、麦芽糖)和非还原性(蔗糖、海藻糖)二糖,在冷冻干燥过程中,还原性和非还原性二糖均有较好的保护效果,但在储存过程中,还原性二糖的存在会使冻干品发生蛋白质褐变反应,最终导致冻干品发生变质。因此,蔗糖和海藻糖是最常用的两种保护剂。并且海藻糖是一种由特殊双糖分子构成的非还原性糖,非常稳定,能够在高温、高寒、干燥失水等恶劣条件下在细胞表面形成特殊的保护膜,有效地保护生物分子结构不被破坏。


  多元醇含有两个或两个以上的羟基,在冷冻干燥中使用较多的是甘露醇、山梨醇和丙三醇(甘油)。甘露醇在慢速冻结时会结晶,可以为活性组分提供支撑结构,同时不会与活性组分发生反应,常作为填充剂使用。山梨醇是甘露醇的同分异构体,溶解度大于甘露醇,但高温下不稳定,一般也用作填充剂。丙三醇可与水以任意比例混合,常作为低温保护剂使用。


  糖和多元醇在生物制品冷冻干燥过程中的保护效果与其添加的浓度直接相关。当浓度提高到一定程度时,对蛋白质的稳定作用能力达到极限,继续增加浓度可能会使冷冻干燥过程中的蛋白质发生变性。


  聚合物在冷冻过程中会优先析出,具有一定的表面活性,能够提高生物制品混合溶液的黏度和玻璃化转变温度,可以抑制小分子赋形剂(如蔗糖)的结晶和溶液pH的降低,并且在蛋白质分子间可以产生位阻作用,一般同时具有低温保护剂和脱水保护剂的作用。最典型的聚合物类保护剂有聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、牛血清白蛋白(BSA)、右旋糖苷、聚乙二醇(PEG)等。PVP常被用作澄清剂、色素稳定剂和胶体稳定剂,对生物制品具有很好低温保存效果的同时,也可以提供很强的支撑作用。BSA在很低的浓度下就可以起到很好地保护效果,作用原理与PVP相同。右旋糖苷也称为葡聚糖,可以抑制冰晶的生长,使冷冻过程具有较好的稳定性,常作为低温保护剂使用。PEG也是很好的低温保护剂,起保护效果与分子量有关,一定程度上其低温保护能力远大于其他低分子化合物。


  表面活性剂在冷冻和干燥过程中降低冰-水界面张力所引起的冻结和脱水变性,也能在复溶过程中对活性组分起到润湿剂的作用,通常使用较低的浓度就可以满足保护效果。(具体原理、分类和应用可查阅前期发表文章“表面活性剂的原理与应用”)


  氨基酸具有酸、碱两性,在生物制品的低温保存和冷冻干燥过程中能抑制溶液的pH变化,从而达到保护活性组分的目的。并且许多氨基酸还具有填充剂的作用,如甘氨酸。


  总之,在冷冻干燥配方中,除了活性组分和溶剂以外,需要使用多种添加剂来提高活性组分在冷冻干燥过程中的稳定性以及使冻干产品的形状规则。添加剂在配方中具体起什么作用,有时很难严格区分开来,即使同一种物质,在不同冻干品中也可能表现出不同的作用。


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